高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography /HPLC）是色谱法的一个重要分支，通过高效、快速的分析分离，可识别、量化和纯化混合物中的单个成分，广泛应用于医药、环保、石化、食品、化工等行业，是现代分离测试的重要手段。色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(station phase)发生作用（吸附、分配、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，又称为色层法、层析法。

色谱法分析示意图

高效液相色谱法以经典的液相色谱为基础，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有颗粒极细的高效固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法的应用范围十分广泛，对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，几乎所有的化合物包括高沸点、极性、离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。

高效液相色谱柱

而高效液相色谱的实际使用中，色谱柱是色谱分离的核心，这与色谱基质填料息息相关。高效液相色谱的基质材料包括填料和整体柱材料，填料可分为无机基质填料和有机基质填料，无机基质填料包括硅胶、氧化铝、氧化锆、羟基磷灰石、氮化物以及活性碳等。此外还有复合物材料，即通过精细调控技术制备的无机-有机球杂交基球，经化学衍生后，制备得对药物分析和筛选很有用的高效、可耐pH2～8、低吸附性的新型填料。

色谱柱及色谱填料示意图

按固定相和分离机理，高效液相色谱技术可分为许多种类，不同的分离机理需要不同的色谱基质材料。

高效液相色谱法的分类

其中，在吸附色谱中，硅胶、氧化铝、活性炭和聚酰胺应用最为广泛。其中活性炭柱色谱尤其适用于分离水溶性物质，如氨基酸、糖类以及某些苷类，它是分离水溶性物质的主要吸附材料之一。色谱分离和分析性能很大程度上取决于色谱填料，现代的色谱填料基本都是由微米级多孔微球组成，就像芯片是电子产品的心脏一样，色谱填料当之无愧是整个色谱分离技术的“心脏”，因此被誉为色谱芯。纵观几大分离色谱，大多数具有特异分离效果的色谱材料均是复合型色谱填料，其中无机填料的应用十分常见。

基质填料种类

1.硅胶（二氧化硅）

无机基质材料中最重要的是硅胶(xSiO₂·yH₂O)，微粒型硅胶的出现，促进了高效液相色谱法的发生与发展。用作色谱填料基质的硅胶是通过人工合成的，其制备方法多样，大都拥有各自的专利。合成色谱用硅胶区别于天然晶体二氧化硅，也区别于介于晶型和无定型之间的用于色谱、电色谱中的石英毛细管，用作色谱填料的是无定型二氧化硅。

由二氧化硅材料组成的色谱材料是分析检测最广泛使用的色谱填料，也是多肽、胰岛素、手性药物等分离纯化最常用的色谱填料。通常，250目~400目（即40μm~63μm直径）的硅胶颗粒的含水量直接影响活性，其活性随着含水量的升高而降低。当其含水量接近20%的时候，硅胶基本不具吸附活性；活性太高则出现不可逆吸附和拖尾，甚至分离物分子结构的改变。

硅胶色谱填料发展历程

硅胶能用于色谱基质材料,是因为其表面具有重要的活性基团硅羟基,即自由硅羟基,或称孤立硅羟基。由于游离的硅羟基是造成色谱峰尤其是碱性溶质拖尾的主要原因，因此在合成反相色谱材料中，针对硅羟基的封尾技术非常重要，即需要一定的表面修饰。

色谱硅胶表面硅羟基示意图

对硅胶表面进行的改性是通过该活性基团进行的，通过各种硅烷化试剂对硅胶表面进行修饰，可以得到包括烷烃和芳烃在内的烷基反相填料。常用的硅烷化试剂除了氯硅烷和烷氧基硅烷外，还有烷基硅氨烷。例如以氨基、羧基、磺酸基修饰，可得到离子交换填料；以聚乙二醇修饰，可得到疏水作用的填料。对于化学键合相硅胶，在孔径、粒径相当的前提下，稳定性是其最重要的指标，这与键合反应的条件控制有关。另外，硅胶的预处理过程对最终硅胶基质填料的稳定性也有十分重要的影响，在预处理过程中，需要无机酸浸泡，以除去硅胶表面存在的会造成峰型拖尾，甚至不可逆吸附强极性杂质的Na⁺、Ca²⁺、Al³⁺、Fe³⁺等金属离子。

硅胶表面修饰

2.氧化铝

用作吸附材料和色谱填料基质的氧化铝主要是γ-氧化铝，γ-氧化铝表面化学修饰比硅胶更困难，因此氧化铝多使用于一些小分子有机化合物的分离，用于正相、

离子交换色谱和反向高效液相色谱中，在生化分离上应用得少。

γ-氧化铝

氧化铝的化学修饰可通过铝羟基的反应或是涂覆技术。

通过铝羟基反应可通过在氧化铝表面上的活性羟基键合C4、C8和C18等烷基，制得在宽pH范围内稳定，应用于反相色谱中的烷基化氧化铝。表面涂覆可以制得聚苯乙烯-二乙烯基、聚丁乙烯或十八烷基硅烷等强疏水性复合材料。

在吸附型制备色谱中，氧化铝的吸附能力比硅胶更强，氧化铝比硅胶的样品处理量更大，根据含水量大小(0%~15%)，大多情况下，需要控制的含水量为6%~10%，

对应的活性为第三和第四等级。根据酸碱性，应用于吸附色谱中的氧化铝分为中性、酸性和碱性氧化铝，中性氧化铝水提取液的pH值为7.5，适用于醛、酮、醌、某些苷及酸碱溶液中不稳定化合物，如酯、内酯等化合物的分离，因此应用十分广泛。大多数情况下使用的是碱性氧化铝，水提取液的pH值为9～10，常应用于碳氢化合物的分离，能中碳氢化合物中除去含氧化合物，还能对某些色素，甾族化合物、生物碱、醇以及其他中性、碱性物质的分离。酸性氧化铝水提取液的pH值为4～4.5，适用于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分离。

典型层析活性氧化铝技术指标

3.氧化锆

氧化锆和硅胶一样，具有优异的机械强度，适宜的孔结构和可用于键合其他功能基团的活性位点外，还具有更宽的pH耐受范围和更好的耐温性。

氧化锆多孔小球可耐受pH 0~14的环境，可高达900℃的温度下长时间工作不会变形且结构不遭受破坏；碳十八键合二氧化锆（ODZ）可在pH 2~12范围内使用；聚丁二烯包覆二氧化锆复合填料在全pH值范围内稳定，并且能耐200℃的柱温。

单分散多孔二氧化锆色谱填料

4.复合型填料

硅胶基质化学键合相在pH 2~8的范围内稳定，难以耐受更宽的pH范围，在碱性条件下硅胶基质会发生溶解，于是人们将机械强度较低、在有机溶剂中易发生溶胀的高聚物引入到硅胶基质填料中，与硅胶形成优势互补，制备出有机-无机复合型填料，即包覆型填料或涂覆型填料。

硅胶、氧化铝、氧化锆等都可用作包覆型填料的基质材料，其中最重要的是硅胶和氧化锆。用于包覆无机基质填料的高聚物则有聚苯乙烯、聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯、聚丁二烯、聚环氧乙烷、聚硅氧烷、琼脂糖、聚氯甲基苯乙烯-二乙氧基甲基乙烯基硅烷以及气相沉积碳等。

早期包覆型填料的制备采用物理包覆法，制得的复合物孔径结构不甚可控，重现性差，后期采用的是化学键合或复合型包覆法。

化学包覆法首先利用无机基质表面修饰技术使硅胶、氧化铝或氧化锆等基质的表面带上适合数量的活性基团，例如可发生加合反应的双键、环氧基团、氨基或羧基等，再将制备高聚物所需的单体、交联剂等涂覆到基质表面，然后通过加入引发剂，控温等条件引发化学键合或共聚反应，制得包覆层紧密牢固的复合色谱填料。但是由于聚合物包覆不完全，会影响吸附效果，可以通过有机物热蒸汽化学气相沉积法使热解碳对裸露无机基质进行包覆。

聚合物包覆填料优势

基质填料的性能表征

对于液相色谱而言，色谱柱最重要的参数主要有粒径及粒径分布、孔径及孔径分布、比表面积以及比孔容、表面形貌、柱效、渗透性及柱压耐受性等物理及表面性质；而化学性质则主要包括基质填料功能基团的结构解析及键合量。

1.物理及表面性质的表征

填料的表面形貌、粒径形状大小及粒径分布主要通过高倍数的扫描电镜进行观测，扫描电镜图是优化填料合成条件强大的直观评价依据；孔径分布和比表面积一般可通过氮吸附法测定，了解基质材料在微孔、中孔及大孔范围内的孔径分布。

扩展阅读：

1.扫描电镜在纳米材料研究中的应用

2.粉体比表面积测试方法对比分析及应用领域

2.化学性质的表征

对于大多数液相色谱填料的功能基团，在中红外、远红外及近红外的指纹区都有相应的特征吸收，因此，可通过红外光谱对其进行结构解析。傅里叶红外光谱在合成填料过程中，通过比较键合前后基质的红外光谱，判别键合试验是否成功。

以反相色谱柱为例，填料通常通过其含碳量来表征表面化学修饰的程度。高效液相色谱柱填料的含碳量在百分之几到百分之二十几之间，现代元素分析仪可测定化学键合硅胶中碳、氢和氧的含量。对于表面由单分子层修饰的基球，可通过含碳量及填料的比表面积计算修饰基的密度，进而对不同填料进行比较。

不同修饰基填料

近年来，固体核磁共振波谱技术也应用于高效液相色谱固定相中，例如在无机基质表面键合C18制备反相色谱柱中，用13C标记C18修饰基团，可通过核磁共振信号判别13C标记苯环修饰基团是否交联到无机基质表面。

参考来源：

1.液相色谱柱基质材料的发展，黄远丽（工程技术）；

2.《从中国色谱“芯”崛起看中国电子“芯”的希望》，江必旺（苏州纳微科技有限公司）。

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