1  引  言

   磷脂( Phospholipids，PLs)是含有磷酸的脂类，它为两性分子，一端为亲水的含磷酸基团的极性头基，另一端为疏水的含有两条长脂肪酸链的非极性尾部。磷脂是生物体内细胞膜的重要组成部分，在细胞信号传导和细胞凋亡方面发挥着重要作用，它也与许多疾病的发生有关，可作为某些疾病的信号分子。磷脂分为两大类：甘油磷酯类和鞘脂类，甘油磷脂又分为卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇等，所以磷脂的种类繁多。

 基于磷脂结构的复杂性和多样性，磷脂分析是一个挑战。常用的有薄层色谱法( TLC)、核磁共振( NMR)、质谱(MS)、气相色谱．质谱联用(GC-MS)和液相色谱．质谱联用(LC-MS)等技术。TLC法灵敏度和分辩率都较低，且易引起磷脂的氧化和分解；CC-MS不适合于直接分析磷脂，因为磷脂没有挥发性，需要经水解、甲酯化等处理；3lp_NMR可利用磷原子3lp来分析各种磷脂，但NMR法的灵敏度较低，仅限于磷脂酰胆碱等组织中含量较高的磷脂样品的测定；MS法，特别是电喷雾质谱(ESI-MS)是目前磷脂分析中应用最多的软电离法，ESI-MS法前处理简单，分析时间短，不足之处在于难以分析丰度较低的磷脂。在此基础上，Han等又开发了基于源内分离的“鸟枪法”和多维质谱法测定磷脂和其他脂质分子。HPLC-ESI-MS具有高分辨率、高灵敏度和特异性强等优点，是磷脂分析的较好工具，但仪器价格昂贵。蒸发光散射检测器（Evaporative light scattering detector，ELSD）作为一种新型通用型检测器，它价格便宜，且无TLC和GC-MS分析磷脂的缺点，在分析过程中不易引起磷脂的氧化和分解，适合直接分析磷脂，在磷脂分析中具有很好的可行性。

   在生物样品中磷脂种类繁多，结构复杂，低丰度检测困难，且干扰较多。如果在应用上述方法分析前，先对磷脂进行选择性提取，对于体内的磷脂分析，特别是对发现一些微量的信号分子是很重要的。常用的磷脂提取方法有甲基叔丁基醚( Methyl tert-butyl ether，MTBE)液．液萃取法和固相萃取法(SPE)。SPE比较常用的是氨丙基、氨基或二醇基修饰的硅胶等正相材料，但这些方法选择性普遍不高。

   金属氧化物（如Zr02等）由于具有路易斯酸一碱的特性，在酸性条件下可以与带有磷酸基团的物质结合，达到与其它物质分离的目的，在碱性条件下洗脱则可达到富集的目的，故金属氧化物选择性富集磷脂是非常有前景的方法，但Zr02本身存在比表面积小，颗粒粒径小，不适合做SPE填料等缺点。本研究采用NH3/H2O内部水解法，将Zr02负载在球形硅胶微球之上，制成核壳型Zr02/Si02颗粒，并填充为SPE小柱，用于选择性富集磷脂，并采用RPLC-ELSD进行评价。结果表明，本研究获得的核壳型Zr02/Si02颗粒具有良好的富集效率，在生物样品分析中有很好的应用前景。

2实验部分

2.1仪器与试剂

   Shimadzu LC-20AB高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ELSD-UM3000蒸发光散射检测器（上海通微分析技术有限公司）；XW-80A漩涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；飞鸽牌TCL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；BrI224S电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；Molatom1805a摩尔原子型超纯水器（重庆摩尔水处理设备有限公司）；S-4800场发射扫描电子显微镜（日本Hitachi公司），Lambda 950紫外可见近红外分光光度计（美国）；C。反相高效液相色谱柱（250 mm x4.6 mm．5ym，苏州环球色谱有限公司）；

   溶血磷脂酰胆碱(1 -Palmitoyl-2 -hydroxy-sn-glycero -phosphocholine，lyso-PC( 16：0))，溶血磷脂酰胆碱(1 -Stearoyl-2 -hydroxy-sn - glycero_3 -phosphocholine，lyso-PC( 18：0))，磷脂酰胆碱（1，2-Dimyristoyl-sn -glyce-ro-3 -phosphocholine，DMPC），磷脂酰乙醇胺(1-Palmitory-2 -oleoyl-sn-glycero-3 -phosphoethanolamine，POPE)，磷脂酰胆碱（1-Palmitory-2 -oleoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine，POPC）均购于美国Avanti PolarLipids公司；乙酸铵（国药集团化学试剂有限公司）；20 um球形硅胶（苏州环球色谱公司）；ZrOCl2．8H20（上海阿拉丁试剂有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，上海星可生化有限公司）；异丙醇、正己烷（色谱纯，上海阿拉丁试剂有限公司）；氯仿（分析纯，国药试剂有限公司）；氨水（分析纯，平湖化学试剂厂）。

2.2实验方法

2.2.1    Zr02/sio2填料制备采用NH3/H20内部水解法，制备二氧化锆包覆的二氧化硅核壳结构填料。过程为：采用相当于3. 5%（Zr02/Si02，w/w）的ZrOC12.8H20水溶液多次浸润20 um球形硅胶，并在60℃不断搅拌直至干燥；在100℃下干燥6h，将ZrOCl2负载的Si02放置进14%氨水环境中，在60℃下水浴约4~6 h，然后在500℃马弗炉内煅烧数小时，即得到3. 5%（Zr02/Si02，w/w）包覆的Zr02/Si02核壳型材料。7% Zr02/Si02( w/w)核壳型材料制备方法与上相似。本实验中所用Zr02对照材料由ZrOCl2.8H20直接煅烧得到。

2. 2.2固相萃取步骤将30 mg Zr02/Si02颗粒装填在1 mL SPE小柱内，SPE小柱的顶部和底部分别放入聚丙烯筛板。取150 uL磷脂标准品或者血浆磷脂提取物，溶解在300 uL含1%甲酸的正己烷一异丙醇(2:8，v/v)溶液内，加入到Zr02/Si02填充的SPE小柱中，平衡后回收流出液，记为流出液(No bindingsolution)；用300 uL正己烷一异丙醇(2:8，wv)溶液清洗SPE小柱，回收清洗液，记为清洗液(Washingsolution)；分别用300 uL 7 mol/L氨水一甲醇溶液洗脱，共3次，合并洗脱液，记为洗脱液(Elution)。

   而对于Zr02，上样、清洗和洗脱步骤同上述SPE方法相同。只是采用离心的方法，涡旋4 min，静置4 min，10000 r/min离心5 min，取上清液。得到流出液、清洗液和洗脱液后，挥干，分别用150 uL甲醇复溶，备用。

2.3    HPLC-ELSD分析

   C8色谱柱(250 mm x4.6 mm，5um)，流动相A:甲醇一水(80:20，V/V）溶液含10 mmol/L乙酸铵，流动相B：甲醇含10 mmol/L乙酸铵。流速：l mUmin，梯度条件：0—15 min，500-/o~100%B；15 ~30 min，100%B。ELSD检测器条件：蒸发温度：45℃，雾化气体：空气，载气流量：2.5Umin，载气压力：322 kPa。

2.4血清样品的制备

   健康人血清样品来自瑞金医院志愿者。血清样品中脂质的提取方法为：取血清样品400 uL，加入3 mL甲醇，超声60 s，加入3 mL氯仿，超声60 s，在室温中静置30 min，加入1.5 mL水，使之分层，1500 r/min离心10 min，取下层有机层，在25℃挥干，并用4 mL含1%甲酸的正己烷一异丙醇(2:8v/v)混合溶液复溶，4℃保存至进样。

2.5 UPLC-Q-TOF分析

   采用2.2.2节的方法提取的血清中的脂质，经过SPE处理为流出液、清洗液和洗脱液，并分别进UPLC-Q-TOF分析。UPLC C8色谱柱（100 mm×2.Imm，1.7um，美国Thermo Fisher公司）及UPLC18保护柱（5 mm×2.1 mm，ASQUITY UPLC-TM，美国Waters公司），柱温为40℃，流速0.4mL／min，流动相同2.3节，梯度为：0-3 min，1% -50%B，3-7 min，50% -100%B，7-15 min，lOOqoB，正离子模式，进样量为2uL，以氮气作为雾化气，飞行管检测模式V型，毛细管电压（Capillary voltage）3 kV，锥孔电压(Sampling cone) 35 kV，离子源温度(Source temperature) 110℃，脱溶剂气温度(Desolvation temperature)300℃，反向锥空气流(Cone gas flow) 50 L/h，脱溶剂气(Desolvation gas flow) 600 L/h，萃取锥孔( Extraction cone)4 V．离子扫描时间(Scan time)0.03 s，扫描时间间隔(Inter scan time)0.02 s，数据采集范围为m/z 50—1500。

3结果与讨论

3.1 ZrOz/Sio2核壳型填料的制备和表征

   在本实验中采用NH3/H2O内部水解法，并用ZrOCl2·8H20替代Zr0( N03)2·2H20，制备了Zr02/Si02核壳型填料。从图可见，Zr02/Si02与Si02形态较为一致，但外表略感粗糙，初步说明在Si02上包覆了Zr02。采用紫外可见漫反射光谱( UV-visible diffuse reflectancespectra)进行固体样品颗粒扫描，包覆有3.5%和7%的Zr02/Si02核壳型填料的吸收光谱与核Si02的吸收光谱有所不同，核壳型填料在300—400 nm相比纯Si02有较强的吸收峰，且包覆比例越高，吸收峰增强越多；另外在2r02可以看到206和230 nm两个吸收峰，其中206 nm是处于四面体结构中的Zr4+_02-之间的电子转移跃迁峰，230 nm是Zr02八面体结构中Zr-O-Zr产生的吸收峰。但对于制备得到核壳型Zr02/Si02材料，只能看到206 nm的Zr4+ _O2-的电子转移跃迁吸收峰，没有230 nm的吸收峰。通过这个数据证明Zr02的确被包覆在Si02表面，且其包覆在Si02表面的Zr02呈高度不饱和的四面体结构。